MAPK (mitogen-activated protein kinase) — семейство внутриклеточных сигнальных каскадов, которые передают информацию от поверхности клетки к ядру и регулируют пролиферацию, дифференцировку, выживание, миграцию и другие клеточные процессы.
В онкологии и дерматопатологии под MAPK-путём чаще всего подразумевают каскад:
лиганд → рецептор → RAS → RAF → MEK → ERK → ядро
Его также называют RAS–RAF–MEK–ERK pathway.
1. Откуда начинается сигнал
В норме MAPK-путь активируется внешним сигналом.
Таким сигналом могут быть, например:
- факторы роста;
- цитокины;
- гормональные сигналы;
- другие внеклеточные сигнальные молекулы.
Сигнальная молекула связывается с рецептором на поверхности клетки.
Во многих случаях речь идёт о рецепторных тирозинкиназах — RTK, receptor tyrosine kinases.
Примеры RTK:
- EGFR;
- KIT;
- FGFR;
- PDGFR.
После связывания лиганда рецептор активируется и запускает передачу сигнала внутрь клетки.
2. Переход сигнала от рецептора к RAS
Сам рецептор не активирует RAS напрямую.
Между ними находятся адаптерные белки, в частности GRB2 и SOS.
Упрощённо:
RTK → GRB2 → SOS → RAS
SOS способствует переходу RAS из неактивного состояния в активное.
3. RAS — молекулярный переключатель
RAS — небольшой GTP-связывающий белок.
Основные представители семейства:
- KRAS;
- NRAS;
- HRAS.
RAS может находиться в двух состояниях.
Неактивное:
RAS–GDP
Активное:
RAS–GTP
То есть:
GDP → выключено
GTP → включено
После активации рецептора SOS способствует замене GDP на GTP, и RAS включается.
Активированный RAS начинает активировать следующий уровень сигнального каскада — RAF.
В норме этот сигнал временный. После гидролиза GTP до GDP RAS снова выключается.
4. RAF
RAF — семейство серин/треониновых протеинкиназ.
К нему относятся:
- ARAF;
- BRAF;
- RAF1, также называемый CRAF.
Активированный RAS связывается с RAF и способствует его активации.
Далее RAF фосфорилирует следующий компонент каскада — MEK.
То есть:
RAS → RAF → MEK
5. MEK
MEK — следующий уровень MAPK-каскада.
Основные белки:
- MEK1, кодируется геном MAP2K1;
- MEK2, кодируется геном MAP2K2.
MEK является протеинкиназой и фосфорилирует ERK.
Таким образом:
RAF → MEK → ERK
6. ERK
Основные представители:
- ERK1;
- ERK2.
После фосфорилирования ERK становится активным.
Фосфорилированный ERK обозначают:
pERK
где p означает phosphorylated.
Активированный ERK может перемещаться в ядро.
7. Что ERK делает в ядре
ERK воздействует на различные транскрипционные факторы.
В результате меняется экспрессия генов, участвующих в:
- клеточном цикле;
- пролиферации;
- дифференцировке;
- выживании;
- миграции;
- взаимодействии клетки с окружающей средой.
Упрощённо весь путь выглядит так:
лиганд
↓
RTK
↓
GRB2 / SOS
↓
RAS–GTP
↓
RAF
↓
MEK
↓
ERK
↓
pERK
↓
ядро
↓
изменение экспрессии генов
8. Зачем нужен каскад из нескольких белков
На первый взгляд можно спросить: зачем клетке столько промежуточных звеньев?
Каскад позволяет:
- усиливать сигнал;
- тонко регулировать его интенсивность;
- регулировать продолжительность сигнала;
- объединять сигналы от разных рецепторов;
- создавать точки отрицательной обратной связи;
- контролировать клеточный ответ на разных уровнях.
Поэтому MAPK — это не просто линейная цепочка, а регулируемая сигнальная сеть.
9. Что происходит при опухолевой трансформации
В норме MAPK-путь включается после внешнего сигнала и затем выключается.
При опухолевых заболеваниях один из компонентов каскада может приобрести генетическое изменение, которое делает его постоянно активным.
Тогда внешний сигнал больше не требуется.
Например, если постоянно активен RAS:
RAS → RAF → MEK → ERK
Если постоянно активен BRAF:
BRAF → MEK → ERK
Если активирован MEK:
MEK → ERK
Во всех этих случаях конечным результатом может стать постоянная передача пролиферативного сигнала к ядру.
10. Мутации RAS
В опухолях могут встречаться активирующие мутации:
- KRAS;
- NRAS;
- HRAS.
При таких мутациях RAS может длительно сохраняться в активном GTP-связанном состоянии.
В результате он продолжает активировать RAF даже без нормального сигнала от рецептора.
Упрощённо:
мутантный RAS
↓
RAF
↓
MEK
↓
ERK
В дерматопатологии особенно важен NRAS.
Мутации NRAS встречаются, например, в части меланоцитарных невусов и меланом.
11. Мутации BRAF
BRAF находится ниже RAS и выше MEK.
Одна из наиболее известных активирующих мутаций:
BRAF V600E
Обозначение расшифровывается следующим образом:
V — valine, валин
600 — позиция аминокислоты
E — glutamic acid, глутаминовая кислота
То есть в позиции 600 валин заменён на глутаминовую кислоту.
Это изменение приводит к конститутивной активации BRAF.
В результате:
BRAF
↓
MEK
↓
ERK
может работать независимо от нормальной активации RAS.
BRAF V600E встречается, в частности, при:
- меланоцитарных невусах;
- меланоме;
- папиллярной карциноме щитовидной железы;
- волосатоклеточном лейкозе;
- некоторых колоректальных карциномах;
- некоторых гистиоцитозах.
Наличие одной и той же мутации в разных опухолях не означает, что эти опухоли имеют одинаковое биологическое поведение.
Значение мутации зависит от типа клетки и других молекулярных изменений.
12. Мутации MAP2K1
MAP2K1 кодирует MEK1.
Если активирующая мутация возникает непосредственно в MAP2K1, путь может включаться уже на уровне MEK.
То есть:
MEK
↓
ERK
при этом мутаций RAS или BRAF может не быть.
Это важный принцип:
отрицательный BRAF не означает неактивный MAPK-путь.
13. Разные мутации — один конечный путь
MAPK/ERK-путь можно активировать на разных уровнях:
RTK
↓
RAS ← NRAS / KRAS / HRAS
↓
RAF ← BRAF
↓
MEK ← MAP2K1 / MAP2K2
↓
ERK
Поэтому разные опухоли могут иметь разные драйверные мутации, но функционально приводить к одному результату — усиленной активации ERK.
14. Что такое драйверная мутация
Драйверная мутация — генетическое изменение, которое способствует развитию или поддержанию опухоли.
Она даёт клетке селективное преимущество.
Например, активирующая мутация BRAF может поддерживать постоянную активацию MAPK-пути.
При этом в опухоли могут присутствовать и другие мутации, которые не являются основными двигателями опухолевого процесса.
Их называют passenger mutations — пассажирскими мутациями.
15. Точечные мутации, делеции, вставки и перестройки
MAPK-путь может активироваться не только точечными мутациями.
Возможны:
- single nucleotide variants;
- небольшие делеции;
- вставки;
- амплификации;
- геномные перестройки;
- gene fusion.
Все эти изменения потенциально могут нарушать нормальную регуляцию сигнального белка.
16. Gene fusion
Gene fusion — образование гибридного гена из частей двух разных генов.
Обычно это происходит вследствие хромосомной перестройки.
Условно:
ген X + BRAF → X–BRAF fusion
В таком случае регуляторная часть BRAF может быть утрачена или изменена, а киназная часть — постоянно активироваться.
В результате снова активируется:
MEK → ERK
То есть один и тот же MAPK-путь может быть включён совершенно разными генетическими механизмами.
17. Что показывает pERK
ERK активируется посредством фосфорилирования.
Поэтому:
ERK — сам белок;
pERK — активированная, фосфорилированная форма ERK.
pERK можно выявлять иммуногистохимически.
Положительная реакция на pERK показывает:
MAPK/ERK-путь активирован.
Но она не отвечает на вопрос:
почему он активирован?
Например, pERK может быть положительным при:
- NRAS-мутации;
- BRAF V600E;
- другой мутации BRAF;
- MAP2K1-мутации;
- активации рецепторной тирозинкиназы;
- других механизмах.
Поэтому pERK — функциональный маркер активности пути, а не маркер конкретной мутации.
18. Иммуногистохимическое выявление конкретной мутации
Некоторые мутантные белки можно выявлять специальными антителами.
Классический пример:
VE1
Это антитело распознаёт мутантный белок BRAF V600E.
Поэтому:
VE1+ → поддерживает наличие BRAF V600E.
Но важно понимать, что ИГХ выявляет белок.
Она не исследует саму последовательность ДНК.
Поэтому VE1 является суррогатным методом определения BRAF V600E.
19. Молекулярные методы
Для непосредственного исследования генетических изменений используют молекулярные методы.
Например:
- PCR;
- real-time PCR;
- ddPCR;
- Sanger sequencing;
- NGS.
Их задача — исследовать непосредственно ДНК или РНК опухоли.
20. NGS
NGS — next-generation sequencing, секвенирование нового поколения.
Вместо исследования одного гена можно одновременно анализировать множество генов.
Например, панель может включать:
- NRAS;
- KRAS;
- HRAS;
- BRAF;
- MAP2K1;
- MAP2K2;
- другие гены сигнальных путей.
NGS может выявлять:
- точечные мутации;
- делеции;
- вставки;
- некоторые амплификации;
- перестройки;
- некоторые gene fusions.
Для поиска fusion часто особенно полезно исследование РНК — RNA-based NGS.
21. Три разных уровня исследования
Важно не смешивать три принципиально разных вещи.
Генетическое изменение
Например:
BRAF V600E.
Это изменение последовательности ДНК.
Определяется молекулярными методами.
Изменённый белок
Например:
мутантный BRAF V600E.
Его можно выявить антителом VE1.
Функциональная активность сигнального пути
Например:
pERK.
Это свидетельствует о том, что конечный участок MAPK/ERK-каскада активирован.
Поэтому:
генетика → что изменено;
мутационно-специфическая ИГХ → какой мутантный белок экспрессируется;
pERK → активен ли MAPK/ERK-путь.
Это три разных вопроса.
22. Клиническое значение
MAPK/ERK-путь является одной из основных мишеней современной таргетной терапии.
В зависимости от молекулярного изменения могут использоваться препараты, воздействующие на разные уровни каскада.
Например:
BRAF inhibitors → BRAF
MEK inhibitors → MEK
Смысл таргетной терапии состоит в том, чтобы подавить патологически активированный компонент сигнального пути.
Именно поэтому важно знать не только то, что MAPK-путь активирован, но и конкретный молекулярный механизм его активации.
Краткая схема
Нормальный путь:
лиганд
↓
RTK
↓
GRB2 / SOS
↓
RAS-GTP
↓
RAF
↓
MEK
↓
ERK
↓
pERK
↓
ядро
↓
транскрипция генов
Основные генетические точки активации:
RAS — NRAS, KRAS, HRAS
RAF — BRAF
MEK — MAP2K1, MAP2K2
Главный принцип:
разные мутации → активация разных уровней каскада → общий конечный результат в виде усиленной передачи сигнала через ERK.